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小鼠白細(xì)胞分化抗原30 ELISA 試劑盒

產(chǎn)品編號(hào)：SEKM-0064

適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

背景介紹：
     CD30 又稱 TNFRSF8，為 TNFR 超家族中的一員，這個(gè)超家族約由十多個(gè)成員組成，如 CD40、Fas、OX40、 CD27 等，這些分子擁有同源可變區(qū)，其特征是在它們胞漿外區(qū)具有高度保守的富含半胱氨酸的偽重復(fù)區(qū)。 CD30 為 I 型跨膜糖蛋白，分子量為 120KD，由分子量為 90KD 的前體在高爾基體上糖化而來(lái)。其基因位于 1p36。 鼠 CD30 表達(dá)于大多數(shù)活化的 CD8+和少數(shù) CD4+T 細(xì)胞，而活化的人 CD8+比 CD4+T 細(xì)胞表達(dá) CD30 更高。CD30 優(yōu)先表達(dá)的 CD4+細(xì)胞產(chǎn)生 1h2 型細(xì)胞因子，如 IL-4、IL-5。研究表明 CD30+T 細(xì)胞和 sCD30 與 Th2 反應(yīng)性 疾病之間存在相關(guān)性。CD30 不僅過度表達(dá)在淋巴系統(tǒng)增生性疾病，而且也過度表達(dá)在一些*的實(shí)體腫瘤， 如胚胎瘤、間葉瘤等。

檢測(cè)原理：
      Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。將抗小鼠 Mouse CD30 / TNFRSF8 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本 中的小鼠 Mouse CD30/TNFRSF8 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 Mouse CD30/TNFRSF8 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 Mouse CD30/TNFRSF8 發(fā) 生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng) 度的非 共價(jià)結(jié)合；洗 板后加入顯 色劑底物 TMB，若反 應(yīng)孔中樣品存 在不同濃度 的小鼠 Mouse CD30/ TNFRSF8，則 HRP 會(huì)使無(wú)色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變 成黃色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠的濃度。

原理圖：

注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄。
3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上，使用前請(qǐng)離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請(qǐng)用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來(lái)源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物
實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購(gòu)）
1． 酶標(biāo)儀（主波長(zhǎng) 450nm，參考波長(zhǎng) 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲(chǔ)存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無(wú)菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），保存過程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測(cè)結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高
于標(biāo)準(zhǔn)品的*值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè)，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)放入
37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1000?1?71?1?778?1?71?1?776L至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后 輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、 15.625、0pg/ml進(jìn)行稀釋。1000pg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的*點(diǎn)濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo) 準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量 分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍

應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法： 

自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。 

手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值。選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，參考波長(zhǎng)為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，請(qǐng) 用 450 nm 的 OD 測(cè)定值減去 630 nm 的 OD 測(cè)定值。

2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中CD30/TNFRSF8含量可通過對(duì)應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠 CD30的樣本含量

2. 靈敏度：
*可檢測(cè)小鼠 CD30濃度達(dá) 8pg/ml，
20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度。

3. 特異性：
不與小鼠的 CD30 Ligand、TNF-α、TNF RI/Fc Chimera、TNF RII，大鼠的 TNF-α，人的 CD30/Fc Chimera、 TNF-α、TNF-β、TNF RI、TNF RII/Fc Chimera 反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的小鼠 CD30，計(jì)算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 CD30，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀 釋，評(píng)估線性。

詳情請(qǐng)咨詢：010-56341250